Naso elettronico e NIR per lo screening della Psa nella propagazione del kiwi

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Dal 2008 è in corso una grave pandemia di cancro batterico dell'actinidia, che investe tutti i principali Paesi produttori ed interessa tanto il kiwi a polpa verde (Actinidia deliciosa) quanto quello a polpa gialla (A. chinensis). L'agente eziologico, il batterio Pseudomonas syringae pv. actinidiae (Psa), mostra una notevole diversità genetica: quattro principali “biovar” sono state identificate in base all'origine geografica (la biovar 3, originatasi in Cina, è responsabile della pandemia).

Inoltre, all'interno della stessa biovar si individuano ceppi con diverse caratteristiche di crescita e di virulenza (Scortichini et al. 2012). La recente esplosione pandemica ha tratto vantaggio dalla diversità genetica e dal particolare habitus del patogeno. Infatti, il batterio è in grado di sopravvivere per lunghi periodi come epifita, senza indurre alcuna sintomatologia (Vanneste et al. 2011); inoltre, quest'ultima si presenta, nei primi stadi, in maniera poco caratterizzante (macchie necrotiche sulle foglie, cancri sui tralci, talvolta emissione di essudato) e variabile. Di conseguenza, comuni pratiche agronomiche, quali il trapianto di materiale vivaistico o le potature, possono diffondere il patogeno a partire da una pianta non riconosciuta come infetta, e l'intervento sanitario successivo all'individuazione dei sintomi non consente di contrastarne la propagazione.

Allo stato attuale, non esistono metodi efficaci di controllo del cancro batterico ed appare pertanto fortemente auspicabile lo sviluppo di un sistema di diagnosi precoce per anticipare il più possibile l'intervento fitosanitario e limitare la diffusione della malattia. Gli attuali protocolli diagnostici si basano sulla caratterizzazione del DNA del patogeno (Han, 2006) ed hanno il pregio di un'elevata sensibilità e specificità. Di converso, gli svantaggi sono costituiti dalla necessità di tempo, manodopera specializzata e costose strumentazioni di laboratorio, dalla distruttività del protocollo e dall'incertezza inerente al campionamento (cioè, la probabilità di selezionare per caso un campione privo di patogeno da una popolazione in cui esso sia effettivamente presente).

Il nostro gruppo si è proposto di migliorare la capacità diagnostica sfruttando le relazioni che si instaurano tra pianta e patogeno a diversi livelli.

Il naso elettronico

Un primo approccio si basa sul fatto che, nel contatto tra pianta e batterio, si generi un profilo specifico di emissioni di composti volatili. La caratterizzazione di tale profilo viene sfruttata ai fini del riconoscimento. Le analisi basate sul rilascio di volatili, seppure meno sensibili e precise rispetto alle metodiche che impiegano il DNA, hanno alcune caratteristiche utili: sono analisi non distruttive e sono meno esposte ad errori di campionamento, poichè consentono, idealmente, di analizzare la pianta intera o l'intero lotto di materiale.

Il naso elettronico (“e-nose”) è uno strumento che include un gruppo di sensori, la cui conducibilità elettrica varia con l'interazione con i vari tipi di molecole presenti nell'aria a cui sono esposti (Pardo e Sberveglieri, 2004). Sebbene non fornisca un'identificazione analitica dei singoli composti che formano la miscela di volatili, si presta all'applicazione su materiale biologico in varie situazioni (da microespianti in vitro, al campo aperto, alla frigoconservazione) grazie alla sua versatilità, rapidità di elaborazione dei dati e semplicità d'uso, e permette di prescindere dalla sintomatologia.

Risultati molto incoraggianti sono stati precedentemente ottenuti da questo gruppo nel riconoscimento di piante di melo sperimentalmente infettate con l'agente causale del colpo di fuoco, Erwinia amylovora (Spinelli et al. 2010): il sistema si è mostrato in grado di riconoscere le piante infette non solo dal controllo sano, ma anche da piante infette con un altro patogeno (Pseudomonas syringae pv. syringae) ed anche in astoni dormienti frigoconservati (asintomatici), a testimonianza della robustezza del metodo in condizioni reali (Cellini et al. 2013).

Riconoscimento di emissioni volatili da piante infette

Nei test di cui in questa nota si riporta la sintesi, è stato tentato il riconoscimento di piante di actinidia (A. deliciosa cv. Hayward) in vitro, infettate per immersione in una sospensione di Psa (108 CFU/ml) per 1 minuto, tramite l'e-nose modello EOS507 (Sacmi Scrl, Imola). I campioni sono stati analizzati tra 0 e 41 giorni dopo l'inoculo. La completa discriminazione statistica dei campioni infetti dal gruppo di controllo è stata ottenuta a partire da 17 giorni post-inoculo (Fig. 1). La quantificazione della popolazione batterica sul peso di tessuto fresco, a fine esperimento, ha mostrato che il campione che si distacca per primo dal gruppo è anche il più infetto, a riprova che il profilo di emissione è indotto dal batterio.

Le piante in vitro infettate con Psa, nella nostra esperienza, spesso non sviluppano una sintomatologia strettamente riconducibile al patogeno, ma mostrano una generica condizione di declino. Pertanto, da questi dati preliminari è possibile concludere che esiste la potenzialità del riconoscimento mediato dai composti volatili emessi da piante anche asintomatiche, e si procederà all'implementazione dello strumento su piante sperimentalmente infette, per poi metterlo alla prova su campioni ignoti. Tuttavia, l'efficacia di questo metodo diagnostico è limitata dal lento sviluppo del batterio: per confronto, nelle stesse condizioni, 30 ore erano sufficienti per riconoscere microespianti di melo infettati con E. amylovora. Inoltre, la scarsa entità delle differenze tra campioni richiede un ulteriore sviluppo tecnico per migliorare il potere discriminatorio della metodica, ad esempio concentrando i composti volatili su una fibra adsorbente.

Individuazione di sintomi incipienti

Il secondo metodo di analisi diagnostica sfrutta l'assorbimento nello spettro infrarosso vicino (NIR) per identificare i primi stadi di formazione dei cancri per mezzo di un prototipo portatile (tipo DA-Meter) sviluppato dal Dipartimento di Scienze Agrarie dell’Università di Bologna (Ziosi et al. 2008). Per decidere se rimuovere o meno un tralcio sospetto, o per stabilire la porzione di tralcio da asportare, si fa riferimenti all’imbrunimento sottocorticale che si osserva nei tessuti infetti. Tale imbrunimento è però rilevabile solo asportando una porzione di corteccia. Tale azione danneggia il tralcio e, se sano, lo espone ad un rischio di infezione. Inoltre, la strumentazione utilizzata per il decorticamento, se contaminata, potrebbe contribuire alla diffusione della malattia.

Uno spettrometro NIR, in grado di penetrare, in maniera non invasiva, gli strati più esterni, consente l'individuazione di sintomi in via di sviluppo e non ancora evidenti e conferire così un vantaggio temporale determinante. Il profilo di assorbimento NIR (Fig. 2) è nettamente distinto nel caso di tessuto sano e infetto, e la rimozione della corteccia conferma la correlazione tra presenza di chiazze rossastre, indicative della presenza del batterio, e l'assenza dei picchi a 790 e 870 nm.

Conclusioni

In conclusione, vari sistemi di diagnosi precoce per il cancro batterico dell'actinidia sono attualmente allo studio e si propongono di affiancare, sebbene non sostituire completamente, i metodi basati sul DNA. In particolare, l'obiettivo è di svincolarsi dalla comparsa dei sintomi nel caso dell'”e-nose” o di anticiparla nel caso del NIR, per creare un punto di controllo di pre-allarme. Il campione biologico verrebbe così incluso in una classe di rischio e l'analisi del DNA potrebbe concentrarsi sui campioni a maggior rischio sanitario. È inoltre possibile pensare ad applicazioni su larga scala adattabili al monitoraggio del materiale vivaistico in pre-impianto o di un intero frutteto dopo l’impianto.

 

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